學術(shù)分享

自7月20日南京祿口機場檢出陽性病例至今，除南京本地日增確診病例是兩位數(shù)外，傳播鏈已經(jīng)波及安徽、廣東、四川、重慶、湖南、遼寧、北京等多個省市。7月30日上午，南京市新聞發(fā)布會就本輪疫情源頭疾控中心通報稱，目前已完成本土疫情相關(guān)的52個病例的病毒基因測序工作，均屬于德爾塔毒株；病毒基因組序列高度同源，提示是同一個傳播鏈。

據(jù)專家比對研究后發(fā)現(xiàn)德爾塔毒株感染者的呼吸道病毒載量是原始毒株感染者的1260倍，患者樣本的核酸檢測Ct值非常低（越低表示體內(nèi)病毒載量越高）。這說明，德爾塔毒株的自我復制速度非常迅猛。此外，攜帶德爾塔毒株的人可能會更快地具有傳染性。研究指出，早期原始毒株在人體內(nèi)可被檢測出來的時間為6天，而德爾塔毒株僅需4天就能被檢測出。

德爾塔毒株感染者病毒載量高，應(yīng)該更容易被檢出，那么還會有漏檢的風險嗎？今天小編帶您揭秘預擴增試劑面對高載量病毒時的漏檢原理。

首先讓我們了解一下什么是預擴增：預擴增是在逆轉(zhuǎn)錄之后，正式開始PCR循環(huán)之前，設(shè)置10個左右不采集熒光信號的循環(huán)。常規(guī)和預擴增PCR程序設(shè)置區(qū)別如下，見下圖（預擴增的3和4是增加的步驟）：

常規(guī)PCR新冠核酸檢測試劑程序：

設(shè)置了預擴增的檢測試劑程序：

設(shè)置預擴增是為了快速提高模板濃度，在后續(xù)帶有熒光采集信號的循環(huán)階段，因為有了前期的預擴增階段對模板的充分擴增，就可以縮短信號采集的時間，將原本需要90-100分鐘的擴增過程縮短至30-40分鐘完成。

那超強變異株德爾塔毒株的核酸檢測情況是什么樣的？因德爾塔毒株病毒載量高，Ct值會更低，在15-20個Ct左右，甚至有樣本Ct值在個位數(shù)的情況出現(xiàn)，檢測曲線如下圖所示，同時儀器判定為陽性。

那新冠核酸檢測試劑如果設(shè)置了預擴增，檢測曲線會發(fā)生什么變化？設(shè)置了預擴增的新冠核酸檢測試劑擴增曲線（圖例僅示意），前10個循環(huán)無熒光信號，從11個循環(huán)開始采集熒光。出現(xiàn)病毒載量超高的德爾塔變異株Ct值為個位數(shù)時，這10個循環(huán)在有預擴增的程序中，儀器將檢測不到指數(shù)增長的起始熒光，最后判定為陰性。

為什么一個簡單的預擴增設(shè)置會導致病毒載量較高的德爾塔毒株最后的檢測結(jié)果變成假陰性？讓我們從實時熒光定量PCR檢測原理來看。實時熒光PCR的曲線分為基線期、指數(shù)增長期、線性增長期與平臺期。（如下圖）

線性圖譜中的基線期，是通過PCR儀內(nèi)部的計算，將原始信號中的噪音計算成熒光信號為“0”的直線，以基線為參照，后續(xù)的熒光信號才被計算機轉(zhuǎn)化為S型曲線。

在普遍情況下，前十幾個循環(huán)以內(nèi)往往都是噪音，所以大多數(shù)PCR儀的自動基線范圍會在3-15。

而設(shè)置了預擴增（例如10個），前10個循環(huán)無熒光信號，從11個循環(huán)開始采集熒光。那么，當遇到病毒載量非常高的樣本，在普通熒光PCR反應(yīng)中，可能在10個循環(huán)以內(nèi)就已經(jīng)開始出現(xiàn)指數(shù)增長期，而這10個循環(huán)在有預擴增的程序中，儀器將檢測不到指數(shù)增長的起始熒光（指數(shù)增長期與閾值線的交點即為Ct值），從而丟失了確保S型擴增曲線完整的關(guān)鍵信號。

因此，帶有預擴增的程序，在當前德爾塔變異株為主流型別的情況下，有非常大的漏檢風險。而且，這樣的漏檢并非是我們常常關(guān)注的弱陽性樣本，而是風險極大的強陽性樣本，越強越容易漏檢。